tophat2 使い方 RNA-Seq マッピング

バイオインフォ道場、くまぞうです。

今回は、tophat2を使って、RNA-seqデータのマッピングに挑戦です。

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tophat2とは

tophat2は、代表的なマッピングツールの1つです。RNA-Seqのデータをスプライシングを考慮してゲノム配列にマッピングします。(tophat2tophat2のインストール

https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml

tophat2の使い方

リファレンス配列とアノテーションファイル

Illumina社が提供しているWebサイトiGenomesでは、代表的な生物に対してリファレンス配列とアノテーションファイル(GTF)を提供しています。データが大きいのでそれなりに適切な対応が必要と思いますが、直近のバージョンも管理されていて利用すると便利だと思います。(iGenomes

基本的な使い方

マッピングを行うリードデータ(fastqファイル:シングル/ペアエンド)と、リファレンス配列・既知のアノテーション情報を準備して、tophat2のコマンドをコールします。必要に応じてオプションを指定しますが、オプションのパラメータのデフォルト値は人などの哺乳類に最適化されていて、リードの長さは75bp以上で最適化されています。前提条件が大きく異なる場合は、パラメータの調整を検討した方が良いかもしれません。

計算を開始すると、データの大きさやコンピュータリソースの使用環境にもよりますが、一般的なデータで最低でも数時間程度は計算が続きます。マッピング結果はbam形式のファイルでaccepted_hits.bamとして得られます。マッピング情報は、align_summary.txtに概要が示されます。

tophat2の一般的な書式

tophat [options] <bowtie_index>  [reads1_2,...,readsN_2]

single-end

tophat -p 4 -G genes.gtf -o tophat_results bowtie_index_genome reads1.fastq

paired-end

tophat -p 4 -r 100 -G genes.gtf -o tophat_results bowtie_index_genome reads1_1.fastq reads1_2.fastq

よく使うオプション

  • -p

    tophatの計算に使用するスレッド数。多いほうが早く結果を得ることができます。しかし、メモリがあまり大きくない場合は、スレッド毎のメモリが小さくなってしまい、エラーが発生することがあります。スレッド数を小さくすると、うまくいく場合があります。

  • -o

    結果を格納するフォルダを指定します。-oで指定したフォルダが存在しないとエラーになります。

  • -G

    既知のtranscriptに関する情報を提供する場合は、gtfまたはgff形式で指定します。

  • -r

    pair-endの場合、リード1・リード2間の距離の期待値を入力します。デフォルトは50ですが、情報が手元にあれば指定した方が良いと思います。

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