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htseq-count 使い方 gene単位・transcript単位の数え方
バイオインフォ道場、くまぞうです。
RNA-Seq解析では、ゲノムに張りついたリードの数を数えます。gene単位・transcript単位の数え方は、オプションで切り替えることができます。
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htseq-count 使い方 gene単位・transcript単位のカウント方法
htseq-countのデフォルト動作はgene単位のカウントです。exon領域に対してgene_id毎に集計します。オプションの-i,--idattrを明示的に指定してGTFファイルの参照情報を変更することで、カウント単位をgene単位やtranscript単位に変更することができます。
GTFファイルの９列目（attribute）の情報で切り替える
GTFファイルは、ゲノムや遺伝子の「位置・遺伝子名・エクソン番号など」の情報を１行毎に記述したファイルです。１行には９つの列があり、タブで区切られています。GTFの９列目には、type/valueで対になった情報（必須：gene_id, transcript_id）を記載します。
htseq-countの-i,--idattrオプションで、GTFの９列目のgene_idまたはtranscript_idを指定します（定義があれば他のIDも指定可能です）。このオプションで指定した単位について、３列目のfeature領域のリードをカウントします。これらは連動するので、どちらかが正しく指定されていない（または定義がない）とエラーが発生します。
1.seqname : 例 Chr1, 1 ... 2.source : 例 hg19（生成プログラム名など） 3.feature : 例 gene, CDS, exon, ... 4.start : 例 1, 1000 （開始位置。先頭は１） 5.end : 例 100,999 （終了位置） 6.score : 例 '.' （任意のスコア） 7.strand : 例 +, -, '.' 8.frame : 例 0, 1, 2, '.' （翻訳開始塩基位置。０はコドン１番目） g.attribute : 例 遺伝子名, gene_id="xxx", transcript_id="xxx"
htseq-count 使い方 gene単位・transcript単位のオプション
| 機能 | 説明 |
|---|---|
| -i, –idattr | リード数をまとめる単位を変更する場合に指定。デフォルトはgene単位。gtfファイルの９列目で定義されているIDを指定。このオプションを変更することで、カウントの単位をgene単位やtranscript単位で切り替える。IDが定義されていれば他のIDも指定可能。 |
| -t, –type | どの領域（exon, mRNA, gene…）で数えるかを指定。デフォルトはexon。gtfファイルの３列目で定義されている情報を指定。カウント領域を変更したい場合に変更。idattrと連動し、idattrで参照する行に指定した |
gene単位・exon領域の指定
デフォルトなので、通常は特に指定しなくてもgene単位・exon領域になります。(bam・samtoolsでソート・non-specific-strandの場合)
htseq-count -f bam -r pos -t exon -i gene_id accepted_hits.bam ref.gtf > count_gene.txt
htseq-count -f bam -r pos accepted_hits.bam ref.gtf > count_gene.txt #同じ設定（デフォルト）
transcript単位・exon領域の指定
transcript単位・exon領域をカウントします。(bam・samtoolsでソート・non-specific-strandの場合)
htseq-count -f bam -r pos -t exon -i transcript_id accepted_hits.bam ref.gtf > count_gene.txt
